加入日期：2018.10.22 瀏覽次數(shù)：77041次
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| WB實(shí)驗(yàn)中化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)的使用 一般的WB檢測(cè)過(guò)程中，都會(huì)有膜的封閉、一抗孵育、二抗孵育和底物顯色這四道“加工”工序。最后的底物顯色是最關(guān)鍵的一部，也是最有文章可作的一個(gè)部分。 WB顯色的方法主要有放射自顯影、底物化學(xué)發(fā)光ECL、底物熒光ECF和底物DAB呈色四種方法，發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL，操作比較簡(jiǎn)單，只需要購(gòu)買現(xiàn)成的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒即可。試劑盒中一般使用的反應(yīng)底物A和B分別是魯米諾(又名發(fā)光氨) 和過(guò)氧化氫，原理如下(二抗用HRP標(biāo)記)：在HRP的催化作用下，魯米諾與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成一種過(guò)氧化物，過(guò)氧化物不穩(wěn)定隨即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體，當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會(huì)產(chǎn)生熒光，可用X膠片和成像設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。使用傳統(tǒng)的X膠片顯影方法進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)時(shí)，最后需要使用暗室曝光來(lái)進(jìn)行ECL檢測(cè)，但是建造暗室浪費(fèi)空間，在暗室中曝光步驟繁瑣，沖洗X光片時(shí)會(huì)接觸有毒的化學(xué)藥劑。化學(xué)發(fā)光成像設(shè)備能夠?qū)CL發(fā)光直接成像，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，避免暗室曝光的不便。 是否能夠拍攝到ECL的圖像主要取決于設(shè)備是不是帶有制冷的CCD，只有制冷的CCD才夠靈敏地捕捉到膜上發(fā)出的光。隨著Cooled-CCD技術(shù)的發(fā)展，成像系統(tǒng)成本越來(lái)越低，因而在現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)室里這些設(shè)備越來(lái)越普遍。本實(shí)驗(yàn)室目前采用的是化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，具有靈敏度高，成像速度快、成像效果清晰等優(yōu)點(diǎn)。 該儀器的使用非常簡(jiǎn)單： 1）在使用前開(kāi)機(jī)預(yù)冷，待儀器溫度降到-20℃才可以進(jìn)行檢測(cè)； 2）將化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒中的A和B按照1:1混合； 3）PVDF膜正面朝上放于暗箱，用移液槍將發(fā)光液均勻地涂在膜上，關(guān)閉暗箱箱門，進(jìn)行曝光； 4）曝光可以自動(dòng)曝光，也可手動(dòng)曝光，一般先點(diǎn)擊自動(dòng)曝光，觀察成像效果，若不理想可再手動(dòng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間； 另外該儀器還具有多張拍攝模式，可將一張膜在不同的曝光時(shí)間下連拍6張，使曝光更方便。 內(nèi)參一般顯影15s（影像條帶粗細(xì)深淺一致說(shuō)明內(nèi)參已調(diào)齊），內(nèi)參好說(shuō)明各步實(shí)驗(yàn)操作均無(wú)誤，即可進(jìn)行后續(xù)的目的蛋白檢測(cè)，目的蛋白結(jié)果的好壞就取決于其表達(dá)量以及抗體的特異性和效價(jià)了。 與X膠片相比，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)具有瞬時(shí)影像處理、立即輸出、不需要膠片處理裝置及暗室等成本花費(fèi)、可用軟件半定量分析等優(yōu)點(diǎn)，因而在現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)室里化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)的使用已經(jīng)逐漸取代傳統(tǒng)的暗室壓片曝光檢測(cè)。 | |
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